Macular dystrophies associated with Stargardt-like phenotypes / Distrofias maculares associadas a fenótipos Stargardt-like

ABSTRACT Purpose: Stargardt-like phenotype has been described as associated with pathogenic variants besides the ABCA4 gene. This study aimed to describe four cases with retinal appearance of Stargardt disease phenotypes and unexpected molecular findings. Methods: This report reviewed medical records of four patients with macular dystrophy and clinical features of Stargardt disease. Ophthalmic examination, fundus imaging, and next-generation sequencing were performed to evaluate pathogenic variants related to the phenotypes. Results: Patients presented macular atrophy and pigmentary changes suggesting Stargardt disease. The phenotypes of the two patients were associated with autosomal dominant inheritance pattern genes (RIMS1 and CRX) and in the other two patients were associated with recessive dominant inheritance pattern genes (CRB1 and RDH12) with variants predicted to be pathogenic. Conclusion: Macular dystrophies may have phenotypic similarities to Stargardt-like phenotype associated with other genes besides the classic ones.

RESUMO Objetivo: Fenótipos Stargardt-like já foram asso-ciados a variantes patogênicas no gene ABCA4. O propósito desse estudo é descrever quatro pacientes com achados retinianos semelhantes a doença de Stargardt com resultados moleculares diferentes do esperado. Métodos: Esse relato fez a revisão de prontuários médicos de quatro pacientes com distrofia macular e achados clínicos sugestivos de doença de Stargardt. Foram realizados avaliação oftalmológica, exames de imagens e testes usando next generation sequencing para avaliar variantes patogênicas associadas aos fenótipos dos pacientes. Resultados: Os pacientes apresentavam atrofia macular e alterações pigmentares sugerindo achados clínicos de doença de Stargardt. Dois pacientes foram associados a genes com herança autossômica dominante (RIMS1 e CRX) e dois pacientes foram associados a genes com herança autossômica recessiva (CRB1 e RDH12) com variantes preditoras de serem patogênicas. Conclusão: Distrofias maculares podem ter similaridades fenotípicas com fenótipo de Stargardt-like associados a outros genes além dos classicamente já descritos.

Intervention of next-generation sequencing in diagnosis of Alzheimer's disease: challenges and future prospects / Intervenção do sequenciamento de nova geração no diagnóstico da doença de Alzheimer: desafios e perspectivas futuras

ABSTRACT Clinical diagnosis of several neurodegenerative disorders based on clinical phenotype is challenging due to its heterogeneous nature and overlapping disease manifestations. Therefore, the identification of underlying genetic mechanisms is of paramount importance for better diagnosis and therapeutic regimens. With the emergence of next-generation sequencing, it becomes easier to identify all gene variants in the genome simultaneously, with a system-wide and unbiased approach. Presently various bioinformatics databases are maintained on discovered gene variants and phenotypic indications are available online. Since individuals are unique in their genome, evaluation based on their genetic makeup helps evolve the diagnosis, counselling, and treatment process at the personal level. This article aims to briefly summarize the utilization of next-generation sequencing in deciphering the genetic causes of Alzheimer's disease and address the limitations of whole genome and exome sequencing.

RESUMO O diagnóstico clínico de vários distúrbios neurodegenerativos com base no fenótipo clínico é difícil devido à sua natureza heterogênea e às manifestações da doença que se sobrepõem. Portanto, a identificação dos mecanismos genéticos subjacentes é de suma importância para um melhor diagnóstico e regimes terapêuticos. Com o surgimento do sequenciamento de próxima geração, o diagnóstico se tornou mais acessível com uma abordagem imparcial em todo o sistema para identificar simultaneamente todas as variantes de genes no genoma. Atualmente, vários bancos de dados de bioinformática sobre variantes genéticas descobertas e indicações fenotípicas estão disponíveis online. Uma vez que os indivíduos são únicos em seu genoma, a avaliação com base em sua composição genética ajudou na evolução do processo de diagnóstico, aconselhamento e tratamento em nível pessoal. Este artigo teve como objetivo resumir brevemente a utilização do sequenciamento de próxima geração para decifrar as causas genéticas da doença de Alzheimer (DA) e abordar as limitações do sequenciamento completo do genoma e do exoma.

Mutações inativadoras no gene MKRN3 são causa de puberdade precoce central familial / Inactivating mutations in the MKRN3 gene are cause of familial central precocious puberty

A maioria dos casos de puberdade precoce central (PPC) em meninas permanece idiopática. A hipótese de uma causa genética vem se fortalecendo após a descoberta de alguns genes associados a este fenótipo, sobretudo aqueles implicados com o sistema kisspeptina (KISS1 e KISS1R). Entretanto, apenas casos isolados de PPC foram relacionados à mutação na kisspeptina ou em seu receptor. Até recentemente, a maioria dos estudos genéticos em PPC buscava genes candidatos selecionados com base em modelos animais, análise genética de pacientes com hipogonadismo hipogonadotrófico, ou ainda, nos estudos de associação ampla do genoma. Neste trabalho, foi utilizado o sequenciamento exômico global, uma metodologia mais moderna de sequenciamento, para identificar variantes associadas ao fenótipo de PPC. Trinta e seis indivíduos com a forma de PPC familial (19 famílias) e 213 casos aparentemente esporádicos foram inicialmente selecionados. A forma familial foi definida pela presença de mais de um membro afetado na família. DNA genômico foi extraído dos leucócitos do sangue periférico de todos os pacientes. O estudo de sequenciamento exômico global realizado pela técnica ILLUMINA, em 40 membros de 15 famílias com PPC, identificou mutações inativadoras em um único gene, MKRN3, em cinco dessas famílias. Pesquisa de mutação no MKRN3 realizada por sequenciamento direto em duas famílias adicionais (quatro pacientes) identificou duas novas variantes nesse gene. O MKRN3 é um gene de um único éxon, localizado no cromossomo 15 em uma região crítica para a síndrome de Prader Willi. O gene MKRN3 sofre imprinting materno, sendo expresso apenas pelo alelo paterno. A descoberta de mutações em pacientes com PPC familial despertou o interesse para a pesquisa de mutações nesse gene em 213 pacientes com PPC aparentemente esporádica por meio de reação em cadeia de polimerase seguida de purificação enzimática e sequenciamento automático direto (Sanger). Três novas mutações e duas...

Most cases of central precocious puberty (CPP) in girls remain idiopathic. The hypothesis of a genetic cause has been strengthened after the discovery of some genes associated with this phenotype, particularly those involved with the kisspeptin system (KISS1 and KISS1R). However, genetic defects in KISS1 and its receptor are rare and have been identified in only a few patients with CPP.over the past years. To date, most genetic studies in CPP was based mainly on a candidate gene approach, including genes selected in animal studies, human models of patients with hypogonadotropic hypogonadism or in genome wide association studies. In the present study, we used whole exome sequencing, a more advanced method of sequencing, to identify variants associated with CPP. Thirty-six patients with the familial form of CPP (19 families) and 213 apparently sporadic cases were initially selected. The familial form was defined by the presence of more than one member affected in the family. Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes in all patients. Whole exome sequencing performed by ILLUMINA technique in 40 members of 15 families with CPP, identified inactivating mutations in a single gene, MKRN3, in five out of these families. Analysis of MKRN3 mutations performed by automatic sequencing in two additional families (four patients) identified two novel mutations. MKRN3 is an introless gene located on chromosome 15, in the Prader Willi syndrome critical region, and it is expressed only by the paternal allele due to the maternal imprinting. Following the initial findings, we searched for MKRN3 mutations in 213 patients with apparently sporadic CPP using polymerase chain reaction followed by direct enzymatic purification and automated sequencing (Sanger). Three new mutations and two previously reported, including four frameshifts and one missense variant was identified in six unrelated girls with CPP. All variants were not described in...

Desenvolvimento da microbiota oral de bebês: análise longitudinal por pirosequenciamento da microbiota de bebês e suas mães dentro de um Programa de Saúde Bucal para Primeira Infância / Development of oral microflora of infants: longitudinal analysis of babies followed in an Oral Health Program for Early Childhood and their mothers’ microflora by pyrosequencing

O estudo da microbiota bucal de bebês e como ela se altera com o tempo é de grande importância para a prevenção, diagnóstico e tratamento de doenças bucais num estágio precoce. O objetivo desse estudo foi avaliarlongitudinalmente, nos períodos de 6, 12, 18 e 24 meses de idade, o microbioma oral de bebês saudáveis e suas respectivas mães por análisede pirosequenciamento. Setenta e quatro pares de mães e bebês acompanhados em um programa de saúde bucal foram incluídos no estudo. Um total de cinquenta e oito participaram em todo o período experimental. A população de bebês foi acompanhada durante todo operíodo, recebendo orientações e procedimentos previstos no protocolodo programa. Dados sobre dieta, higiene bucal, presença de dentes, prevalência de cárie e condições periodontais de bebês e suas respectivas mães foram coletados. Para a análise de pirosequenciamento, foram selecionados 5 pares de bebês e mães seguindo rigorosos critérios de inclusão para obtenção de amostra homogênea de bebês que se mantiveram sem a ocorrência de doenças bucais durante todo o período de avaliação. Também foram analisadas amostras do único bebê que desenvolveu cárie ao longo do estudo. Foram coletadas amostras de saliva e biofilme dentário do bebê e suasrespectivas mães para análise da diversidade microbiana porpirosequenciamento 454 dos produtos de PCR do gene 16S ribossomal. A eficácia do programa de promoção de saúde bucal para este estudo foi reiterada com a ocorrência de cárie em apenas 1 dos bebês (1,51%)acompanhados durante 24 meses. A diversidade microbiana da saliva ebiofilme dentário dos bebês manteve-se estável em relação ao número de Filos ao longo dos períodos. Observou-se aumento considerável de gêneros na saliva dos bebês dos 6 meses aos 12 meses de idade do bebê, sendo que esta distribuição se manteve nos demais períodos. Aos 12 meses, 77 diferentes gêneros faziam parte do microbioma do biofilme dentário do bebê, sendo este número maior quando comparado ...

Data on infants’ oral microflora and how it changes in time is of utmostimportance for the prevention, diagnosis and treatment of oral diseases inearly stages. The goal of this study was evaluate, longitudinally, in the periodsof 6, 12, 18 and 24 months of age, the oral microbiome of healthy babies andtheir mothers by pyrosequencing analysis. Seventy-four pairs of mothers/babies followed in a Program of Oral Healthy were included in thestudy. A total of fifty-eight participated in all the experimental period. Thepopulation of babies was followed during all the period, receiving orientationon oral health and procedures foreseen in the protocol of the referredprogram. Data on diet, oral hygiene, presence of teeth, prevalence of caries,and periodontal conditions of babies and their mothers were collected. Forpyrosequencing analysis, 5 pairs of babies and mothers were selectedfollowing rigorous criteria of inclusion, in order to obtain a homogeneoussample of babies who did not develop caries during all the evaluation period.Also, samples from of the only baby who developed caries along the studywere analyzed. Samples of saliva and dental biofilm from the babies andmothers were analyzed for the microbial diversity by pyrosequencing 454 ofproducts of PCR of 16S ribosomal gene. The effectiveness of the Oral HealthProgram in this study was confirmed with the occurrence of caries in only 1 ofthe babies (1.51%) followed during 24 months. Salivary and biofilm microbialdiversities of babies were stable in relation to the number of Phyla during the evaluation periods. A considerable increasing in the number of genus inbabies’ saliva was observed in the period of 6 to 12 months of age. After thisperiod, the distribution was stable. At the age of 12 months, 77 differentgenus were found in the microbioma of infants’ dental biofilm and this valuewas higher when compared to saliva. High similarity between the relevantgenus in babies and ...

Desenvolvimento da microbiota oral de bebês: análise longitudinal por pirosequenciamento da microbiota de bebês e suas mães dentro de um Programa de Saúde Bucal para Primeira Infância / Development of oral microflora of infants: longitudinal analysis of babies followed in an Oral Health Program for Early Childhood and their mothers’ microflora by pyrosequencing

O estudo da microbiota bucal de bebês e como ela se altera com o tempo é de grande importância para a prevenção, diagnóstico e tratamento de doenças bucais num estágio precoce. O objetivo desse estudo foi avaliarlongitudinalmente, nos períodos de 6, 12, 18 e 24 meses de idade, o microbioma oral de bebês saudáveis e suas respectivas mães por análisede pirosequenciamento. Setenta e quatro pares de mães e bebês acompanhados em um programa de saúde bucal foram incluídos no estudo. Um total de cinquenta e oito participaram em todo o período experimental. A população de bebês foi acompanhada durante todo operíodo, recebendo orientações e procedimentos previstos no protocolodo programa. Dados sobre dieta, higiene bucal, presença de dentes, prevalência de cárie e condições periodontais de bebês e suas respectivas mães foram coletados. Para a análise de pirosequenciamento, foram selecionados 5 pares de bebês e mães seguindo rigorosos critérios de inclusão para obtenção de amostra homogênea de bebês que se mantiveram sem a ocorrência de doenças bucais durante todo o período de avaliação. Também foram analisadas amostras do único bebê que desenvolveu cárie ao longo do estudo. Foram coletadas amostras de saliva e biofilme dentário do bebê e suasrespectivas mães para análise da diversidade microbiana porpirosequenciamento 454 dos produtos de PCR do gene 16S ribossomal. A eficácia do programa de promoção de saúde bucal para este estudo foi reiterada com a ocorrência de cárie em apenas 1 dos bebês (1,51%)acompanhados durante 24 meses. A diversidade microbiana da saliva ebiofilme dentário dos bebês manteve-se estável em relação ao número de Filos ao longo dos períodos. Observou-se aumento considerável de gêneros na saliva dos bebês dos 6 meses aos 12 meses de idade do bebê, sendo que esta distribuição se manteve nos demais períodos. Aos 12 meses, 77 diferentes gêneros faziam parte do microbioma do biofilme dentário do bebê, sendo este número maior quando comparado...

Data on infants’ oral microflora and how it changes in time is of utmostimportance for the prevention, diagnosis and treatment of oral diseases inearly stages. The goal of this study was evaluate, longitudinally, in the periodsof 6, 12, 18 and 24 months of age, the oral microbiome of healthy babies andtheir mothers by pyrosequencing analysis. Seventy-four pairs of mothers/babies followed in a Program of Oral Healthy were included in thestudy. A total of fifty-eight participated in all the experimental period. Thepopulation of babies was followed during all the period, receiving orientationon oral health and procedures foreseen in the protocol of the referredprogram. Data on diet, oral hygiene, presence of teeth, prevalence of caries,and periodontal conditions of babies and their mothers were collected. Forpyrosequencing analysis, 5 pairs of babies and mothers were selectedfollowing rigorous criteria of inclusion, in order to obtain a homogeneoussample of babies who did not develop caries during all the evaluation period.Also, samples from of the only baby who developed caries along the studywere analyzed. Samples of saliva and dental biofilm from the babies andmothers were analyzed for the microbial diversity by pyrosequencing 454 ofproducts of PCR of 16S ribosomal gene. The effectiveness of the Oral HealthProgram in this study was confirmed with the occurrence of caries in only 1 ofthe babies (1.51%) followed during 24 months. Salivary and biofilm microbialdiversities of babies were stable in relation to the number of Phyla during the evaluation periods. A considerable increasing in the number of genus inbabies’ saliva was observed in the period of 6 to 12 months of age. After thisperiod, the distribution was stable. At the age of 12 months, 77 differentgenus were found in the microbioma of infants’ dental biofilm and this valuewas higher when compared to saliva. High similarity between the relevantgenus in babies and...

Estudo clínico, histológico e molecular da miopatia centronuclear / A clinical, histological and molecular study of centronuclear myopathy

Introdução: A miopatia centronuclear é uma doença muscular congênita com apresentação clínica heterogênea, caracterizada histologicamente pela proeminência de fibras musculares com núcleos centralizados. Três formas são reconhecidas: neonatal grave, com herança ligada ao X e envolvimento do gene MTM1; autossômica dominante, com início geralmente tardio e curso mais leve, associada a mutações no gene DNM2; e autossômica recessiva, com gravidade intermediária entre as outras formas e envolvimento dos genes BIN1, RYR1 ou TTN. Apesar da identificação dos principais genes responsáveis pela doença, os métodos usuais de diagnóstico genético não encontram mutações em cerca da metade dos casos. Objetivo: O objetivo deste estudo foi a caracterização clínica, histológica e molecular de pacientes brasileiros portadores de miopatia centronuclear. Métodos: Laudos de dois bancos de biópsia muscular foram usados para identificar pacientes com diagnóstico de miopatia centronuclear nos últimos dez anos. As lâminas das biópsias foram revisadas e analisadas, e as famílias correspondentes convocadas para aplicação de protocolo clínico e coleta de sangue periférico para extração de DNA genômico. As famílias foram estudadas para os genes conhecidos por sequenciamento Sanger, MLPA, painel de genes implicados em doenças neuromusculares ou sequenciamento de exoma. Resultados: Foram convocados 24 pacientes provenientes de 21 famílias, em 16 das quais foi possível estabelecer o diagnóstico molecular. As 7 famílias com a forma neonatal grave constituíam um grupo homogêneo clínica e histologicamente, e mutações novas e conhecidas foram encontradas no gene MTM1 em 6 destas. Dois meninos deste grupo, com evolução estável, tiveram óbito súbito por choque hipovolêmico subsequente a rompimento de cisto hepático. O gene MTM1 também foi implicado em uma menina portadora manifestante, com quadro mais leve, na forma de uma macrodeleção em heterozigose, detectada por MPLA...

Introduction: Centronuclear myopathy is a heterogeneous congenital muscle disease, characterized by the prominence of centralized nuclei in muscle fibers. Three disease forms are recognized: a severe neonatal, X-linked form caused by mutations in the MTM1 gene; an autosomal dominant, late-onset milder form, associated to the DNM2 gene; and an autosomal recessive form, with intermediate severity, so far with the BIN1, RYR1 or TTN genes implicated. In spite of the identification of these genes, usual molecular diagnostic methods don't yield a molecular diagnosis in about half of cases. Objetives: The aim of this work was to study clinical, histological, and molecular aspects of centronuclear myopathy Brazilian patients. Methods: Reports taken from two muscle biopsy banks were used to identify centronuclear myopathy patients in the last ten years. Biopsy slides were reviewed and analyzed, and corresponding families recruited to apply a clinical protocol and to draw peripheral blood to extract genomic DNA. Families were studied for known genes via Sanger sequencing, MLPA, panel of genes implicated in neuromuscular diseases, or exome sequencing. Results: Twentyfour patients out of 21 families were recruited, and in 16 families molecular diagnosis was established. The 7 families with the severe neonatal form amounted to a clinically and histologically homogeneous group, and mutations, both known and novel, were found in the MTM1 gene in 6 of these. Two boys of this group, with a stable course, died suddenly of hypovolemic shock due to a hepatic cyst rupture. The MTM1 gene was also implicated in the case of a mild manifesting carrier girl with a heterozygous macrodeletion detected via MLPA...

Câncer de mama hereditário: rastreamento de mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 e busca de novos genes de susceptibilidade / Hereditary breast cancer: screening for mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes and search for new susceptibility genes

O Câncer de Mama Hereditário (HBC) é uma doença autossômica dominante caracterizada, principalmente, por mutações germinativas nos genes BRCA1 e BRCA2 que conferem alto risco em desenvolver câncer de mama e ovário. A identificação da causa genética responsável pelo aumento de risco em mulheres com critérios clínicos para HBC é extremamente importante para o manejo das mesmas. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar mutações pontuais germinativas e alterações no número de cópias (CNV) nos genes BRCA1 e BRCA2 em 128 famílias brasileiras, as quais preencheram os seguintes critérios para HBC: 108 para Câncer de Mama e Ovário Hereditário (HBOC), 20 para Câncer de Mama e Colón Hereditário (HBCC), sendo que 32 preencheram critérios clínicos para ambos. Amostras de DNA de sangue periférico foram utilizadas para avaliar a presença de mutações germinativas através do sequenciamento completo dos genes BRCA1 e BRCA2 nas sequências codificadoras e limites éxon-íntron e também verificar as mutações pontuais nos genes TP53 (R337H) e CHEK2 (1100delC). Os pacientes não portadores de mutações nos genes BRCA1/2 foram selecionados para análise de MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) para avaliar as CNVs nestes genes. A prevalência de mutações patogênicas neste estudo foi de 25% (32/128), incluindo 21 no BRCA1 (2 splice site, 2 missense, 9 frameshift, 6 nonsense e 2 CNVs), 7 no BRCA2 (3 frameshift e 4 nonsense), 3 no TP53 (3 missense) e uma no gene CHEK2 (1100delC). Sete (25% - 7/28) das mutações patogênicas identificadas nos genes BRCA1 e BRCA2 foram descritas pela primeira vez neste estudo, cinco no gene BRCA1, incluindo uma nova mutação no sítio de splice no BRCA1, cuja patogenicidade foi confirmada através da análise do transcrito; e duas no gene BRCA2...

Hereditary Breast Cancer (HBC) is an autosomal dominant disease mainly characterized by germline mutations in BRCA1 and BRCA2 genes that confer high risk for developing breast and ovarian cancer. The identification of high-risk women carrying mutations responsible for the disease is extremely important for their management. Thus, the aim of this study was to evaluate germline mutations and copy number variations (CNVs), in BRCA1 and BRCA2 in 128 Brazilian families, who met the following criteria for HBC: 108 for Hereditary Breast and Ovarian Cancer (HBOC) and 20 for Hereditary Breast and Colon Cancer (HBCC). Thirty two patients met clinical criteria for both syndromes. DNA samples from peripheral blood were used to assess the presence of germline mutations by capillary sequencing of the entire coding sequence of BRCA1 and BRCA2 genes, exon - intron boundaries, as well as TP53 (R337H) and CHEK2 (1100delC) variants. Patients who did not carry mutations in the BRCA1/2 genes were selected for MLPA analysis (multiplex ligation-dependent probe amplification) to assess CNVs in these genes. The prevalence of pathogenic mutations in this study were 25 % (32 /128) , including 21 in BRCA1 (2 splice site, 2 missense, 9 frameshift, 6 nonsense and 2 CNVs), 7 BRCA2 (3 nonsense and 4 frameshift ), 3 in TP53 (3 missense) and one in CHEK2 gene. Seven (25 % - 7/28) out of 28 pathogenic mutations in BRCA1 and BRCA2 genes were first described in this study, of which five were in the BRCA1, including a novel splice site mutation, whose pathogenicity was confirmed by transcript analysis and two in the BRCA2 gene. Among the VUS carriers 18 different were found variants, where two of them were described for the first time. The analysis of the three algorithms for protein prediction of VUS ( Polyphen, SIFT and AlignGVGD) showed that seven variants have been classified as probably pathogenic in at least one of them (four in one algorithm , two in two algorithms and one...